2017年，瑕瑜课题组在Analytical Chemistry杂志上发表了题为“Thiyl Radical-Based Charge Tagging Enables Sterol Quantitation via Mass Spectrometry”的论文。本文的通讯作者是清华大学化学系瑕瑜教授，其指导的2015级博士毕业生Sarju Adhikari为本文第一作者，发表单位为清华大学化学系和普渡大学化学系。
文章内容简介
受到巯基自由基和烯烃反应的高反应活性和特异性的启发，本课题组开发了一种新的电荷衍生方法，通过ESI-MS实现固醇的快速定量分析。巯基乙酸（TGA）是一种高效的标记试剂且易于获取。TGA经光引发产生的巯基自由基能够夺走固醇B环中的烯丙基氢，形成的自由基中间体又可快速与第二个巯基自由基结合以产生最终的标记产物。由于引入了羧基，TGA标签不仅能够使固醇的检测限降至亚纳摩尔量级，还可以利用特征性的44 Da中性丢失完成其定量。自由基衍生化反应在微流反应器中进行，速度快（1分钟）且高效（> 90％产率）。本文以定量人血浆和植物油中固醇来验证巯基自由基电荷标签方法的可行性。
固醇是对动物，植物和真菌都必不可少的天然脂质分子，它通常包含不饱和的四环结构（A，B，C，D环），一个3β-羟基（OH）和一条连接C17的脂族侧链。固醇主要具有两方面的生物功能，一是调节膜的流动性，二是作为类固醇，维生素D，激素和许多其他信号分子的前体。气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）是分析复杂混合物中固醇的主要方法。
由于GC-MS灵敏度和通量较低，最近人们致力于使用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）来提高分离能力和分析通量。另一方面由于固醇具有非极性性质，需要对其进行电荷衍生化来提高固醇在ESI中的响应。现有的衍生方法主要有：（1）羟基官能团与电荷标签形成酯键；（2）首先将羟基转化为酮，然后使用羰基化学将电荷标签加到固醇上。这些方法显著提高了ESI对固醇的分析能力，检测限（LOD）能够低至纳摩尔级甚至亚纳摩尔级。然而衍生反应通常需要几个小时甚至几天才能完成，一些衍生化试剂需要自己合成，从而限制了这些方法的广泛应用。
硫基自由基对烯烃具有高反应活性，能够形成碳-硫键，被称作“点击化学”。受此启发，本文旨在发展硫基自由基化学为基础的高效电荷衍生化策略，增强ESI-MS对非极性分子的分析检测能力。本文选择固醇作为例子，首次展示此概念。
硫醇-烯反应的反应条件：硫醇试剂（100 mM）和固醇（5μM）共溶解在二甲基甲酰胺（DMF）中，加入1 mM 2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA）作为光引发剂，以实现巯基自由基的形成，反应在微流反应器中进行，并用351nm发射波段的低压汞灯照射。下图比较了负离子模式下固醇在TGA标记之前和之后的nanoESI-MS谱图。由于去质子化的羧酸部分的存在，TGA标记的固醇的串联质谱（MS / MS）分析均显示大量CO2分子丢失。根据[TGA-Chol-H]-的离子强度绘制的反应动力学曲线显示反应在50 s内达到了稳态。
前面提到TGA标记的固醇在串联质谱中易失CO2，在该特征性碎裂途径的基础上，44 Da中性丢失扫描（NLS）被用作TGA标记的固醇的定量。下图展示了1μM胆固醇，添加5μM胆固醇-d7（Chol-d7）作为内标（IS）的代表性的44 Da NLS谱图。通过[TGA-Chol-H]-和[TGA-IS]-的峰面积比对胆固醇浓度绘制的校准曲线呈良好线性关系（R2 = 0.9968）。LOD为0.5 nM（S / N比> 3），最重要的是TGA标记和后续MS分析的时间缩短到少于2分钟。
由于TGA标记固醇的选择性和灵敏性，此方法非常适合无需事先提取的少量脂质样品的分析。将20μL人血浆用DMF稀释10倍并用TGA衍生化（1分钟紫外光照射），下图c显示了44 Da NLS谱图。除了TGA标记的胆固醇峰（m / z 475.4）外，其他含量更低的固醇，例如脱氢胆固醇（m / z 473.4；原质量384.6 Da），菜油固醇（m / z 489.3；原质量400.37 Da）和谷固醇（m / z 503.3；原质量414.4 Da）也被检测到。
本文还对从杂货店购买的大豆油中的植物固醇进行了定量分析，多种TGA衍生的固醇，包括菜籽固醇（m / z 487.3），菜油固醇（m / z 489.3），豆固醇（m / z 501.3），β-谷固醇（m / z 503.3）和环状固醇（m / z 515.3）在44 DaNLS的谱图中都清晰可见（图d，5μM Chol-d7作为IS）。研究发现，更高比例的固醇以游离而不是酯化的形式存在。同时，β-谷固醇被发现是含量最高的固醇（游离和酯化形式均是），然后是豆固醇和菜油固醇。
总而言之，本文发展了一种快速简单的巯基自由基标记的电荷衍生化方法，可应用于对复杂混合物中的固醇进行定量分析。
本文编辑：杨晓月 审核：张龙飞
本文链接：
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b04080
本文引用：10.1021/acs.analchem.7b04080