2019年，清华大学瑕瑜课题组在Chemical Science上发表题为“A Lipidomic Workflow Capable of Resolving sn- and C=C Location Isomers of Phosphatidylcholines”的论文。本论文的通讯作者是清华大学瑕瑜教授，第一作者为其指导的2017级博士生赵雪。该文利用气相离子自由基碎裂实现了磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholines,以下简称为PC)中sn位置异构体的鉴定与定量,并结合课题组此前发展的Paternò-Büchi反应，建立了对PC中sn-和C=C位置鉴定和定量的高通量分析平台。
磷脂酰胆碱(PC) 是哺乳动物甘油磷脂中含量最多的一种脂类，在细胞膜构建，信号传导和基因调控等方面发挥着重要的作用, 由甘油骨架连接两条脂肪酸链和胆碱磷酸头部基团构成。由于脂肪酸的链长、sn-位置、以及脂肪酸链上碳碳双键（C=C）位置具有多样性，导致了PC类脂质分子的结构繁多，也给精确结构分析带来挑战。PC的指纹图谱以及它的代谢通路研究可能为疾病诊断与治疗提供新的方向。目前利用质谱对PC sn-位置异构体的分析方法主要有EIEIO(J. Larry Campbell et al., Anal.Chem, 2015),OzID(Huong T. Pham et al., Analyst, 2016)和UVPD(Peggy E. Williams et al., J. Am. Chem. Soc, 2017),存在着分析灵敏度低、结构解析能力不足，或需对质谱仪器进行改造的多种局限。
本课题组巧妙地利用碳酸氢根与胆碱磷酸头部基团之间强结合力，仅在CID中即可实现C-N均裂，生成碳自由基中间体。此自由基引导的碎裂形成了只和sn-1位置相关的 “sn-1 fragment”(如图1)，基于sn-1 fragment诊断离子比例可以对PC的sn-位置异构体进行定量。该方法对PC标准品混合物中的sn-位置异构体的定量结果与金标准酶解法（PLA2）具有很高的一致性。此外利用特异于胆碱磷酸头部基团的中性丢失扫描(121Da NLS,-H2CO3 和N(CH3)3)可以实现复杂生物样品中PC的高灵敏检测和定量，检测限为10 pM左右。
图 1
本课题组近年来发展了Paternò-Büchi(简称PB反应)耦合串联质谱(MS/MS)可对多种脂类中的C=C位置异构体进行鉴定，已经实现了鸟枪法(X. Ma and Y. Xia, Angew. Chem. Int. Ed., 2014; X. Ma et al., PNAS, 2016)及液相色谱-质谱联用(W. Zhang et al., Nat. Commun., 2019)。由于碳酸氢铵可以作为缓冲溶液引入液相色谱流动相中，因此该sn-异构体鉴定方法可以与液相色谱、在线 PB 反应、串联质谱分析耦合，实现复杂生物样品中PC的高通量的sn-及C=C位置精细结构解析，工作流程由三次LC-MS/MS组成(如图2)。第一次在负模式下进行121Da NLS实现PC亚类鉴定和相对定量(图中未标出)，第二次运行(对[M+ HCO3]-进行MS2CID)确定PC的脂肪酸酰基组成、sn-位置，以及sn-异构体组成比例，第三次在正模式情况下进行LC-PB-MS/MS确定C=C位置和比例。
图 2
基于该分析流程，在牛肝脏脂质提取物中共鉴定了82个PC分子，其中包含19对sn-位置异构体。我们还将该分析平台应用到临床样品的检测中，在乳腺癌疾病组织和正常组织共鉴定的80个PC分子中，有5对sn-位置异构体表现出显著性差异（P<0.001）。
综上所述，本课题组发展了一种新型气相自由基碎裂方法，可以仅在传统CID条件下实现磷脂酰胆碱sn-位置异构体的定性与定量。其与LC-PB-MS/MS的结合，建立了PC的高通量、高灵敏的全面结构解析平台，对乳腺癌疾病组织和正常组织检测结果也揭示了PC的sn-位置异构体成为生物诊断标志物的潜力。乳腺癌组织中sn-异构体与双键位置异构体的检测结果揭示了饱和脂质与不饱和脂质异构体在作为生物诊断标志物时的互补性。
本文编辑：简瑞君
审核：赵雪
本文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlepdf/2019/sc/c9sc03521d
本文引用：DOI：10.1039/C9SC03521D