碳-碳双键（C=Cs）、环丙烷和甲基支链等链内修饰对细菌膜稳态至关重要。例如，大肠杆菌（E. coli）、结核杆菌等利用环丙烷修饰来增强膜流动性并维持膜在恶劣环境中的稳定性； 甲基支链修饰与pH、温度适应有关，经常出现在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）等革兰氏阳性菌中。然而，甘油磷脂（GPL）的偶电子离子在碰撞诱导解离 (CID)下，通常倾向于发生电荷定向裂解，并不产生与链内修饰相关的结构诊断离子。近期，清华大学化学系瑕瑜教授课题组在J. Am. Soc. Mass Spectrom.上发表了以“Localization of Intrachain Modifications in Bacterial Lipids Via Radical-Directed Dissociation”为题的文章，该文的第一作者为清华大学化学系博士生林巧红。在这项研究中，作者介绍了一种自由基诱导解离 (radical-directed dissociation，RDD) 方法，用于表征细菌膜中甘油磷脂酰乙醇胺 (PE) 的链内修饰。
如图1所示，作者将可在低能 CID 下高效产生苄基或吡啶甲基自由基的自由基引发剂（TPN、TBN）通过衍生化连接到 PE 的氨基基团上。产生的碳中心自由基离子随后引发酰基链内的RDD过程，生成可用于鉴定、定位链内修饰（包括 C=C、环丙烷环和甲基支链）的产物离子。除了链内裂解之外，发生在甘油骨架内的RDD会引发脂肪酰基链以R·+CO2的形式发生中性丢失，由此生成的产物离子可用于鉴定PE的链组成。对于含环丙烷或C=C的PE标准品，本方法的最低鉴定限可达25 nM，灵敏度比UVPD至少高两个数量级。
图1 TPN-PE在CID下所引发的主要RDD途径：链内裂解和脂肪酰基链裂解。
作者将上述 RDD 方法整合到液相色谱-质谱的分析工作流程中，并应用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的脂质提取物中PE、LPE的分析。如图2所示，大肠杆菌中的PE 34:2可以被鉴定为PE 18:1(n-7)_16:1(n-7)（86%）与PE 17:1(cn-7)_17:1(cn-7)。最终，作者一共从大肠杆菌的脂质提取物中鉴定出了22种PE分子，包括6种含环丙烷的PE分子、10种含C=C的PE分子以及3种既含环丙烷又含C=C的PE分子，鉴定结果如图2e所示。
图2 大肠杆菌中PE 34:2的结构鉴定以及总鉴定结果。
由于PE的两条脂肪酰基链都会发生RDD，本方法无法将甲基支链定位到特定的酰基链上，因此作者采用PLA2水解去除sn-2脂肪酰基链。在PLA2水解的枯草芽孢杆菌脂质提取物中，作者一共鉴定到了14种LPE分子，它们具有异甲基、反异甲基或者链酰基链。
总而言之，本文开发了一种由低能CID触发的RDD方法，用于PE、LPE中链内修饰基团的结构表征。本方法通过CID可高效地形成脂质自由基离子，规避了UVPD裂解C-I键须进行仪器改造的局限性。同时，RPLC可以将PE的链组成异构体分离，以实现异构体的相对定量分析。UVPD虽也与RPLC偶联，但目前还未用于异构体的定量分析。未来，作者将尝试将本方法扩展到其他氨基脂类的分析，例如甘油磷脂酰丝氨酸（PSs）、鞘氨醇等。
编辑：林巧红
审核：张东晖 瑕 瑜